易游体育:病原生物学专业论文）二乙烯亚胺对脊髓灰质炎病毒Sabin株灭活效果以及灭活疫苗添加佐剂的效果观察来源：易游体育 发布时间：2026-06-19 11:56:03
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前言……………………………………………………………………………………４ 日Ｕ舌……………………………………………………………………………………４
一材料和方法………………………………………………………………………．．５
二结果和分析…………………………………………………………………………１０
四小结………………………………………………………………………………．１８
参考文献………………………………………………………………………………１９
第二部分Ｓａｂｉｎ株脊髓灰质炎病毒灭活疫苗（ＳａｂｉＩｌＤＶ）与佐剂配伍的动物
前言…………………………………………………………………………………．．２１ 刖舌…………………………………………………………………………………．．２ｌ
一材料和方法………………………………………………………………………．２３
二结果和分析………………………………………………………………………．３０
三讨论………………………………………………………………………………．４５
四小结………………………………………………………………………………．４８
参考文献………………………………………………………………………………４９
论文综述………………………………………………………………………………５ｌ
附录……………………………………………………………………………………５９
致谢……………………………………………………………………………………６１
研究生简历…………………………………………………………………………．．６２
随着全球消灭脊髓灰质炎（脊灰）目标的临近，疫苗衍生脊灰病毒（ＶｋｃｉＩｌｅ．
ｄｅｒｉｖｅｄＰｏｌｉｏｖｉｎＩｓ，ＶＤＰＶ）的流行、疫苗相关麻痹型病例（Ｖ如ｃｉｎｅＡｓｓｏｃｉａｔｅｄＰ删如ｃ
Ｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，Ⅵ心Ｐ）的发生等对无脊灰状态成果的巩固威胁很大。在消灭脊灰的
最后阶段，应尽快消灭脊灰野毒株，并使用脊髓灰质炎灭活疫苗（Ｉｎａｃｔｉｖａｔｅｄ
ｐｏｌｉｏｖｉｎｌＳｖａｃｃｉｎｅ，ＩＰＶ）替代目前普遍的使用的脊髓灰质炎减毒活疫苗（Ｏｒａｌｐｏｌｉｏｖｉｍｓ
ｖａＣｃｉｎｅ，ＯＰＶ）来维持无脊灰状态，消除自然界的活病毒。考虑到疫苗生产的生物
安全性等因素，ＷＨＯ鼓励研制Ｓａｂｉｎ株脊髓灰质炎灭活疫苗（ＳａｂｉｌｌＩＰＶ）。
本论文旨在针对ＳａｂｉｎＩＩ型病毒，寻找一种与传统灭活剂一甲醛相比较，对病
毒的抗原破坏更小，且更安全的病毒灭活剂；并进一步探索ＳａｂｉｎＩＰＶ中添加佐剂
本研究第一部分进行了二乙烯亚胺（ＢＥＩ）对脊髓灰质炎病毒ＩＩ型Ｓａｂｉｎ株的灭
活效果观察。通过在不一样的温度下采用４种浓度的ＢＥＩ及甲醛对脊髓灰质炎病毒ＩＩ型
Ｓａｂｉｎ株进行灭活，测定活病毒含量和Ｄ抗原含量，并进行病毒灭活验证试验。结
果在３７℃条件下，０．００２ｍｏｌ／Ｌ浓度的ＢＥＩ能在４８ｈ内完全灭活病毒，灭活后的病
毒液Ｄ抗原含量回收率为９０．６％，明显高于甲醛灭活的回收率（６０．６％）。经验证灭
活彻底，无活病毒存在。ＢＥＩ对脊髓灰质炎病毒ＩＩ型ＳａｂｉＩｌ株的Ｄ抗原破坏小，能
本研究的第二部分四组不同剂量的ＳａｂｉｌｌＩＰＶ疫苗与佐剂Ａｌ（ＯＨ）３配伍后免疫
Ｗｉ咖大鼠，通过检验测试各组大鼠免疫后血清中和抗体水平、特异性ＩＦＮ吖的产生情
况以及免疫后各组大鼠ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８分子表达的差异，以确定使用Ａｌ（ＯＨ）３佐剂
时ＳａｂｉｎＩＰＶ的最适剂量。通过微量中和实验检测ＳａｂｉＩｌ株脊髓灰质炎特异性中和
抗体发现，疫苗不同剂量产生的中和抗体ＧＭＴ水平基本是抗原含量高的组高于抗
原含量低的组，添加Ａｌ（ＯＨ）３佐剂组的中和抗体水平也是高于未添加佐剂组的中和
抗体水平。ＥＬＩＳＰＯＴ测定针对Ｓａｂｉｎ株脊髓灰质炎病毒的特异性ＩＦＮ吖的结果显示，
添加佐剂实验组产生的斑点要多于未添加佐剂组，２．①实验组三个型别所产生的斑
点数都最多。流式细胞仪检测各组大鼠ＣＤ３／ＣＤ４／ＣＤ８分子表达差异的结果显示，
１．①实验组ＣＤ３＋ＣＤ４＋／ＣＤ３＋ＣＤ８＋比值最高。综上所述，添加佐剂对三个型别的Ｓａｂｉｎ
ＩＰＶ的免疫反应有增强的效果；综合实验结果可认为Ｉ型采用３０ＤＵ／ｄｏｓｅ，ＩＩ型采
ｗｉｔｈ砒ｅｎｕａＬｔｅｄ ｖｉｎｌｓ， Ｓａｂｉｎ ｓｔｒａｉｌｌ，ｉｎ
ｓｅｅｋｓｔｏａｄｄｒｅｓｓＳａｂｉｎＩＩ ｖｉｍｓ，ｔｏｌｏｏｋｆｏｒａｂｅｔｔｅｒｉｎａｃｔｉｖａｔｏｒ，ｗｈｉｃｈｈａｓ
ｏｂｓｅⅣｅｍｅｉｎａｃｔｉＶａｔｉｏｎｅ彘ｃｔｏｆＢＥＩｏｎＳａｂｉｎｓｎ面ｎ
Ｏ．００２ｍｏⅥ。ｃｏｎｃｅｎｎ砒ｉｏｎ ｏｆＢＥＩａｔ ３７℃ｆｏｒ４８ｈｏｕｒ’ｓ ｉｎｃｕｂａｔｉｏｎ．Ｔｈｅ
ｓｉ鲥ｆｉｃ觚ｔｌｌｉ曲ｅｒ恤ｎ６０．６％ｒｅｃｏＶｅｒｙ晰ｔｈｆｏｍａｌｄｅｈｙｄｅ．
ｐｏｌｉｏＶｉｍｓ，ｉｎｄｉｃａｔｉｎｇａ伊ｅａｔｅｒｐｒｏｔｅｃｔｉｖｅ
ａＩｌｄＷｉｓｔａｒｒａｔｓｗｅｒｅｉｎｕｎｕｎｉｚｅｄ．Ｗｅｄｅｔｅｃｔｅｄｓｅｍｍ
ＣＤ３＋ＣＤ４＋／ＣＤ３＋ＣＤ８＋ｒａｔｉｏｉｓ ｔｈｅｍａｘｉｍ啪．Ｉｎ
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ＰｏｌｉｏＶｉｍｓ；ＢｉｎａｒｙｅｍｙｌｅＩｌｉｌｎｉｎｅ；ｉｎａｃｔｉＶａｔｉｏｎ；Ｓａｂｍｓｎ址ｎ；ａｄｊｕＶａｎｔ
能侵袭任何年龄人群，但主要是３岁以下的儿童（占所有病例的５０％），造成肢体
不可逆转的麻痹甚至死亡。２０世纪４０～５０年代，工业化国家大规模的脊髓灰质炎流
行，每年造成数千万儿童麻痹，一度引起恐慌。２０世纪５０年代末６０年代初，有效
的疫苗应用之后不久，脊髓灰质炎得到了控制。脊髓灰质炎作为一个重要的卫生问
题为发展中国家所认识，经历了稍长时间。２０世纪７０年代的脊髓灰质炎减毒活疫
苗（ＯＰＶ）常规免疫计划的一部分帮助许多发展中国家控制这种疾病。１９８８年第
４１界世界卫生大会通过了到２０００年全球消灭脊髓灰质炎的决议后，全球消灭脊灰
已取得了很大进展。到２００５年，脊灰的发病数比１９８８年减少了９９％，世界卫生组
织美洲区、西太平洋区、欧洲区先后实现无脊灰，剩下主要在南亚和撒哈拉周边的
尽管口服脊髓灰质炎减毒活疫苗（Ｏｒａｌｐｏｌｉｏｖｉｍｓｖａｃｃｉｎｅ，０ＰＶ）为控制脊灰的
发病和流行做出了巨大贡献，但随着全球消灭脊灰任务的逐步实现，ＯＰＶ的缺点也
日益凸现，例如ＯＰＶ热稳定性较差，在热带地区效力较低，ＯＰＶ可引起疫苗相关麻
ｐａｒａｌｙｔｉｃｐｏｌｉｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，ＶＡＰＰ）病例和疫苗衍生脊灰病
ｐｏｌｉｏｖｉｍｓｅｓ，ＶＤＰＶ）病例的风险，以及免疫抑制者长期排毒、全国
强化免疫成本高难度大等，另外只要使用ＯＰＶ就会有病毒循环，难以发现野病毒循
环。因此ＯＰＶ的安全性在消灭脊灰的最后阶段愈来愈受到大家的广泛关注【２】。使用
灭活脊髓灰质炎疫苗（ＩＩ瑚ｔｉｖａｔｅｄｐｏｌｉｏｖｉｎｌｓｖａＣｃｉｎｅ，ＩＰＶ）能够尽可能的防止上述风险，也只有
使用ＩＰＶ才能最终根除脊髓灰质炎。目前使用的ＩＰＶ已与过去Ｓａｌｋ研发的ＩＰＶ有很大
的不同，２０世纪７０年代，丹麦和法国的科学家发现了细胞培养、灭活、收获高浓度
的病毒。现今的ＩＰＶ免疫原性更好，降低粪便排毒量和减少排毒时间，可以和ＤＴＰ、
乙型肝炎疫苗、Ｈｉｂ等制成联合疫苗，减少免疫次数。另外从其他几个国家使用ＩＰＶ的经
验来看，如１９７７年美国医学会推荐成人使用ＩＰＶ，１９８８年推荐使用ＩＰＶ联合疫苗，１９９５
年建议儿童转为ＩＰＶ，１９９７年推荐使用ＩＰＶ／ＯＰＶ序贯程序，１９９９年推荐使用序贯程
序或全程ＩＰＶ程序，２０００年美国建议使用全程ＩＰＶ。美国在使用ＩＰＶ前每年ＶＡＰＰ发生
８～１０例，转为序贯程序后，每年发生５例左右，转为全程ＩＰＶ后，不再有ＶＡＰＰ发生。
２００８年全球有３５个国家（包括部分发展中国家，如墨西哥等）使用全程ＩＰＶ【３】。
目前全球有６个厂商在生产ＩＰＶ，但生产所使用的毒种均为野毒株。在全世界消
灭脊髓灰质炎后，用野毒株生产ＩＰＶ，生物安全４级的生产条件亦非绝对安全。对于
疫苗生产厂商也难以达到如此严格的生物安全要求，因而ＷＨＯ鼓励新疫苗厂家研发
使用减毒株Ｓａｂｈｌ株生产的脊髓灰质炎病毒灭活疫苗（ＳａｂｉＩｌＩＰｖ）。但由于以下两个
原因ＳａｂｉｎＩＰＶ的研发面临巨大困难：一是其免疫原性弱于野毒株制备的ＩＰＶ；二是
ｓａｂｉｎ毒株灭活后，疫苗的抗原性会发生明显的变化，不同于野毒株。针对ｓａｂｉｎＩＰＶ的第
一个问题，主要是在疫苗制备过程中的灭活环节免疫原性损失较大。在三个型别的
病毒中又以ＩＩ型病毒的免疫原性在灭活时破坏更明显。因此寻找一种比传统疫苗
基结合形成羟甲基衍生物或二羟甲基衍生物，后者再与酰胺发生交联反应，使病毒
蛋白质变性，进而达到灭活病毒的目的。现今使用的口Ｖ也是用甲醛来进行灭活，
而早在１９５６～１９５８年就有研究者证明甲醛在灭活脊灰病毒时的反应不是一个线性的
（ｆｏｏｔ．ａｎｄ．ｍｏｕｔｌｌ ｄｉｓｅａｓｅ）病毒时得出。另一类灭活剂二乙烯亚胺（Ｂｉ彻ｎ，
ｅｔｈｙｌｅｎｉｍｉｎｅ，ＢＥＩ）属氮丙啶（Ａ２ｉｒｉｄｉｎｅ）类化合物，是由２．溴乙胺氢溴酸盐
核酸代谢，破坏病毒核酸达到灭活病毒的目的，对某些病毒的抗原影响小。ＢＥＩ灭
活病毒的过程是个线性的灭活过程，这在早年研究ＦＭＤ疫苗时得到证明【５１。近年
来ＢＥＩ用于灭活口蹄疫病毒，羊蓝舌病毒【６】’鸡法氏囊病病毒ｍ，流感病毒【８１等研
究，都显示ＢＥＩ有较好的灭活效果。因此本研究以甲醛作对照，对不同浓度的ＢＥＩ
在不同温度下，灭活脊髓灰质炎病毒ＩＩ型Ｓａｂｉｎ株的效果进行观察，以寻找ＳａｂｉｎＩＰＶ
脊髓灰质炎病毒ＩＩ型Ｓａｂｉｎ株ＳＯ＋２接种Ｖｅｒｏ细胞，经３７℃培养，出现细胞
病变效应（Ｃｙｔｏｐａｔｈｉｃｅｆ．ｆｅｃｔ，ＣＰＥ）“＋＋＋）后，．２０℃冻融３次，１２０００ｒ／ｍｉｎ离
用２．溴乙胺氢溴酸盐（ＢＥＡ）与Ｏ．２Ｎ的ＮａＯＨ溶液在３７℃下水浴ｌｈ（每隔
１５．２０ｍｉｎ摇匀一次）配制成所需浓度的ＢＥＩ灭活液‘５１，４℃存放备用。
在制备好的病毒液中分别加入终浓度为Ｏ．００２，Ｏ．００ｌ，０．０００５，０．０００２５ｍｏⅥ。
的ＢＥＩ和Ｏ．０９２５ｍ幽ｍ的甲醛，之后将病毒液分别放置于３７℃，３３℃，２８℃，２５℃
培养箱。并于第１天至第１２天每天取样，加入阻断剂终止灭活（每毫升病毒液加
入２．２％亚硫酸氢钠０．１４叫中和甲醛；加入ＢＥＩ使用量１０％的１ｍｏ儿硫代硫酸钠中
１）用稀释液将不同时间段取样的灭活样品进行１０倍系列稀释至１０～，稀释后将每
２）使用对数生长期Ｈ印．２细胞，经胰酶消化后加入适量细胞生长液，吹打混匀后
进行细胞计数。再用细胞生长液将细胞悬液稀释至所需浓度（约为１００，０００个
３）向细胞培养板中加入１００ｐｌ的Ｈｅｐ．２细胞悬液，设正常细胞对照，放置３５℃，
体，可作为ＩＰＶ效力体外测定的指标，它与体内免疫原性有较好的一致关系，故用
ＥＬＩＳＡ方法对ＳａｂｉｎＩＰＶ疫苗Ｄ抗原的含量进行测定，既可以测出疫苗的抗原性，
采用牛抗脊髓灰质炎病毒ＩｇＧ作为捕获抗体（一抗），兔抗脊髓灰质炎病毒ＩｇＧ
作为检测抗体（二抗），使用鼠抗兔ＩｇＧ．ＨＲＰ作为酶标抗体，用ＴＭＢ作为底物。
显色后用２Ｎ的硫酸终止反应，在酶标仪上用４５０／６３０姗检验测试吸收值。样品通过其
１）包被液：磷酸盐缓冲液（ＰＢＳ），１０ｎｕｎｏｌ／Ｌ，ｐＨ７．２．７．４
５）ＴＭＢ贮备液：６ｍ咖１，ＴＭＢ３０ｍｇ溶于５ｍｌ无水乙醇中，存放于棕色瓶中。
６）柠檬酸．柠檬酸钠缓冲液（ＴＭＢ稀释液，ｐＨ５．０，Ｏ．１ｍｏｌ／Ｌ）柠檬酸钠１８．６８９，
７）显色液：柠檬酸．柠檬酸钠缓冲液＋１％ＴＭＢ贮备液＋Ｏ．０２％的３０％Ｈ２０２
９）捕捉抗体（一抗）：ＩＩ型经纯化获得的牛抗Ｓａｂｉｎ－ＰｏｌｉｏＩｇＧ（本室制备）。
１０）检测抗体（二抗）：ＩＩ型经纯化获得的兔抗Ｓａｂｉｌｌ．ＰｏｌｉｏＩｇＧ（本室制备）。
１１）Ｄ抗原参考品：Ｓａｂｉｎ株脊髓灰质炎灭活疫苗效力试验参考品批号：２００４０１，
１）包板：用ＰＢＳ将ＩＩ型一抗按特殊的比例稀释后，加入酶标板。每孔１００ｐｌ，Ａｌ孔
２）封闭：将酶标板中的包被液甩干，洗板３次，每次加洗板液２００Ｕｌ。加封闭液每
３）加抗原：甩干封闭液，洗板３次。用稀释液将参考品和样品稀释至适宜浓度（参
考品按８、４、２、ｌ、０．５、０．２５ＤＵ／ｍｌ作六个稀释度），加入酶标板，每孔１００ＩＪｌ。
４）加二抗：洗板３次，用稀释液将ＩＩ型二抗稀释到适宜浓度加入酶标板，每孔ｌｏｏＵｌ，
５）加酶标抗体：洗板４次，用稀释液将酶标抗体稀释到适宜浓度加入酶标板，每
６）加ＴＭＢ．底物：每孔（含Ａ１孔）加入ＴＭＢ使用液ｌｏｏｌＪｌ，３７℃避光１０分钟。
８）检测：酶标仪双波长（检测波长４５０１１Ｉｎ，参考波长６３０啪）测吸收值，记录各
测ＯＤ值一阴性对照平均值；将参考品的６个稀释度的Ｄ抗原含量作为横坐标，对
应的平均ＯＤ值为纵坐标，绘制标准曲线。根据样品各个稀释度的平均ＯＤ值对照
采用细胞培养法，灭活终止时从每一病毒液中取样。每毫升病毒液加入２．２％亚
硫酸氢钠０．１４Ｉｎｌ中和甲醛后，将样品分做两份接种到Ｈ印．２细胞单层物上。每ｌｍｌ
样品至少接种３ｃｍ２的培养面积。留２份细胞不接种样品作为对照，接种样品的细
胞于３６士１℃培养观察３周，称为原始培养。分别于１４天和２１天取原始培养的细胞
培养上清液传代，传代培养物继续培养１４天。原始培养结束时，每瓶检查残余活
病毒的原始培养物加入１００ｌｇＣＣＩＤ５加ｌＩＩ型病毒液１ＩＩｌｌ进行攻击，需产生特异性病
２）原始培养，将生长成单层的Ｈ印．２细胞用洗涤液洗细胞面，以去除Ｐ０１ｉｏｖｉｒｕＳ抑
３）将取样样品接种到细胞上，补加Ｍ１９９维持液，置３６士１℃培养，设正常细胞对
４）培养３周，显微镜下观察细胞病变，于第１４和２１天由每一细胞培养瓶中分别
５）３周观察期结束时，进行Ｐｏｌｉｏｖｉｍｓ敏感性试验，每瓶加入ｌｏｏｌｇＣＣＩＤ５（加１１同型
６）再培养，由每原始瓶中分别收集１４天上清液接种到新的己生长成单层的细胞培